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原核蛋白表達技術服務

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最后更新：2022-12-16
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生產企業：北京百歐泰生物科技有限公司

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產品詳細介紹服務簡介
細菌表達系統是一種比較理想的蛋白質表達系統，它是生產重組蛋白和抗體的優先選擇，而且許多細菌已經被很好地研究利用。原核蛋白表達系統是常用的表達系統，在大量細菌中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細胞系是常用的重組蛋白表達宿主，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產物分離純化相對簡單等優點。
大腸桿菌和枯草芽孢桿菌可以在適宜條件下以很低的成本快速復制，而且表達水平高，這種特性使其成為大規模生產的有效和經濟的方式。此外，他們的基因組已完全測序，遺傳背景和代謝途徑眾所周知。另外，由于結構簡單，細菌比真核生物更容易轉染。這些優勢特征使表達過程更容易和更快速。
但在某些方面，原核蛋白表達系統也有其局限性。雖然，可以利用細菌比較容易地表達具有少量修飾的蛋白質，但需要考慮到細菌中沒有細胞核，高爾基體和內質網。而這些結構在細胞運輸和翻譯后修飾（PTM）過程中是必需的。因此，細菌表達系統不能表達膜結合蛋白，例如胰島素受體、血型糖蛋白以及某些酶等。由于很多蛋白質在正確折疊中需要這種修飾，而細菌無法完成修飾，導致細菌中產生的很多蛋白質是無活性的并且不起作用。由此看來，客戶必須根據蛋白質的結構和功能特性選擇合適的蛋白表達系統。

服務內容
百歐泰生物具有多種表達宿主菌，客戶可以根據實際需要，選用不同融合標簽蛋白、不同抗性、不同作用元件的表達載體和不同性質的表達宿主。本公司可提供的服務包括以下幾類，客戶可以提供目的基因序列或建好的表達質粒，本公司提供一站式基因合成和蛋白表達與純化服務或重組蛋白表達與純化服務。

實驗原理
在原核蛋白表達體系中，外源基因通常需要誘導劑的誘導才能進行表達，以E.coli（大腸桿菌表達系統）為例，使用誘導劑IPTG誘導表達原理如下：
原核生物絕大多數的基因按功能相關性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個轉錄單位——操縱子，也稱基因表達的協同單位。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y、A三個結構基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基轉移酶（transacetylase)；此外還有調控基因：操縱序列O（operator）、啟動+序列P（promoter）；而I(編碼Lac阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。
Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結構蛋白，都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態，Lac阻遏物（即阻遏蛋白）能與操縱基因O結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結合，阻止了轉錄的路徑，從而抑制轉錄啟動。而當有誘導劑（這里指IPTG）存在時，誘導劑可與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白構象發生變化，導致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，啟動子P開始發生轉錄，啟動反應開始發生轉錄。
在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經β-半乳糖苷酶催化，轉變為半乳糖——即生理上的誘導劑。而在實驗中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導劑，IPTG是一種作用很強的誘導劑，不被細菌代謝且十分穩定，因此實驗室使用較多。

實驗步驟
測序驗證
序列比對
重組質粒酶切
蛋白表達分析鑒定（11度低溫誘導體系）
重組蛋白親和純化（Ni親和樹脂一步親和純化）
純化后蛋白Sumo蛋白酶酶切
Sumo蛋白酶酶切后第二次親和純化
得到酶切后目的蛋白

實驗服務流程
雙方溝通一致后確定實驗方案，確定服務要求-簽訂合同—預付款-開始實驗-成果交付

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